LA SORVEGLIANZA MICROBIOLOGICA

LA SORVEGLIANZA MICROBIOLOGICA IN PAZIENTI AFFETTI DA FIBROSI CISTICA AFFERENTI AL CENTRO DI SUPPORTO PROVINCIALE DI TRENTO PER LA CURA DELLA
R. Gazzini, P. Gualdi, L. Collini, M. Schinella, G. Dinnella*, C. Guerzoni*, E. Baldo*.
Laboratorio Chimica Clinica e Micrologia, * U.O. Pediatria – Servizio di supporto provinciale per la cura della Fibrosi Cistica.
Ospedale S. Maria del Carmine. P.le S: Maria 6 38068 Rovereto (TN)

Introduzione:

La Fibrosi Cistica ( FC ) o mucoviscidosi è una malattia congenita, cronica, evolutiva, trasmessa con meccanismo autosomico recessivo più frequente nella popolazione caucasica, con un’ incidenza che varia da 1:2500 a 1: 2700.
La fibrosi cistica è secondaria ad un’anomalia della proteina chiamata CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) localizzata nella membrana apicale delle cellule degli epiteli e la sua funzione principale è quella di regolare gli scambi idroelettrolitici.
Il gene che codifica per questa proteina è stato localizzato nel 1989 sul braccio lungo del cromosoma 7 in posizione 31.2.
La malattia si trasmette con carattere autosomico recessivo e la frequenza dei portatori sani (eterozigoti) è di 1:20-25 individui sani (circa il 4-5% della popolazione).
Quando un uomo e una donna entrambi portatori del gene difettoso decidono di avere un figlio la probabilità che esso sia malato di fibrosi cistica è del 25%. Inoltre esso avrà il 50% di probabilità di essere sano ma portatore della malattia ed il 25% di essere sano e non portatore. Ad ogni gravidanza il rischio è sempre lo stesso.
La figura 6 illustra le probabilità che hanno, ad ogni gravidanza, due genitori portatori del gene difettoso.



Fig. 6

In particolare nelle regioni Veneto e Trentino-Alto Adige, le quali attuano un programma di screening neonatale di massa, l’incidenza osservata è di 1:2600 nati vivi e di 1:27 per quanto riguarda i portatori sani (eterozigoti).

La FC è una malattia genetica multisistemica caratterizzata, nella sua forma classica, da un esordio in epoca neonatale-infantile e da un quadro che comprende ipersalinità del sudore, insufficienza pancreatica esocrina e grave e progressiva broncopneumopatia cronica.
Fino a pochi decenni fa la malattia era di pertinenza quasi esclusivamente pediatrica a causa dell’esordio in età infantile e della prognosi tipicamente infausta entro le prime due decadi di vita.
Attualmente, sia per l’evoluzione delle strategie terapeutiche sia per il riconoscimento di forme di malattia relativamente miti o incomplete, il profilo epidemiologico della FC è notevolmente mutato; infatti quasi la metà dei pazienti è attualmente rappresentata da adulti. 

La FC produce secrezioni dense che danneggiano particolarmente l'apparato respiratorio e quello digestivo. I sintomi più comuni sono tosse ricorrente, ripetute infezioni delle vie aeree, diarrea persistente e magrezza (con difficoltà di crescita nell'infanzia). Questi sintomi non sono specifici della fibrosi cistica, per questo spesso viene confusa con altre malattie.
Gli organi o apparati coinvolti nella fibrosi cistica sono: 

  • Apparato respiratorio: la sua compromissione è presente nella quasi totalità dei pazienti ed è responsabile del decorso e della prognosi della malattia. I microrganismi responsabili delle infezioni broncopneumoniche sono: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae; Pseudomonas aeruginosa; batteri gram-negativi non fermentanti e miceti. Una combinazione di fisioterapia, aerosolterapia e trattamento antibiotico può controllare le infezioni respiratorie e limitare l’evoluzione del danno polmonare. 
  • Intestino: è compromesso a vario livello e nelle diverse età in circa il 90% dei pazienti FC. La mancata emissione di meconio (materiale presente nell’intestino di tutti i neonati) nei primi giorni di vita con conseguente occlusione intestinale è la manifestazione clinica più precoce della FC.
  • Pancreas: l'insufficienza pancreatica con deficit non solo di enzimi, ma anche di bicarbonati, si evidenzia precocemente e interessa circa il 90% dei pazienti FC. Dopo l'adolescenza può rendersi evidente una ridotta tolleranza al carico glucidico che più o meno rapidamente evolve in diabete insulino-dipendente per compromissione della funzione endocrina del pancreas. 
  • Fegato e dotti biliari: già in età neonatale la bile particolarmente densa e vischiosa può dar luogo ad ittero da stasi. La calcolosi biliare è un'evenienza abbastanza frequente e spesso asintomatica.
  • Ghiandole sudoripare: un cenno particolare deve essere riservato alla sindrome da perdita di sali attraverso il sudore che può condurre ad uno squilibrio metabolico anche molto grave, che può essere sintomo d'esordio preminente, frequente quando la sudorazione è particolarmente intensa soprattutto nei primi anni di vita (febbre, caldo, iperattività fisica). Eccessiva perdita di acqua e sale può portare ad una disidratazione del paziente con conseguente collasso. 
  • Apparato riproduttivo: nei pazienti FC maschi adulti si può avere azoospermia per atresia/assenza dei dotti deferenti che causa sterilità nel 95%; nelle donne l'ipofertilità è decisamente meno frequente ed è correlata alla particolare vischiosità del muco della cervice o alle gravi condizioni cliniche che interferiscono sui cicli mestruali. Sempre più numerose sono le pazienti che possono affrontare la gravidanza che per lo più decorre regolarmente e con buon esito.

 Negli ultimi anni è stato documentato che nella FC può essere compromesso anche il metabolismo osseo con evidenza, in un numero se pur limitato di pazienti, di osteoporosi; le cause possono essere molteplici: malnutrizione, epatopatia, ridotta attività fisica, uso di corticosteroidi. 

La fibrosi cistica "classica" è quella che associa sintomi respiratori e intestinali che compaiono in genere nei primi mesi o primi anni di vita. Ci possono però essere forme che non danno sintomi per anni, sono in genere forme con andamento più mite oppure con sintomi limitati solo ad alcuni organi: queste forme sono dette "atipiche". 

La storia naturale della FC è condizionata principalmente dal grado di interessamento del polmone, che si manifesta con un progressivo decremento della funzionalità respiratoria. Le infezioni polmonari si presentano con modalità ricorrente e cronica e persistono per tutta la durata della vita del paziente, generando uno stato di flogosi che sta alla base del danno polmonare. Infatti, il polmone di pazienti FC rappresenta un ambiente favorevole alla colonizzazione da parte di batteri patogeni opportunisti. 
Le infezioni polmonari causate da batteri sono particolarmente rilevanti nei pazienti FC perché rappresentano sia il fattore di innesco e di mantenimento delle lesioni polmonari sia la causa principale di morbidità e mortalità in FC. 

Le infezioni respiratorie sono causate da un limitato numero di germi opportunisti, una volta avvenuta la colonizzazione da parte di un batterio, si assiste alla sua diffusione a livello di tutto l’apparato respiratorio.    Il  sistema   immunitario   dell’ospite  è   però    incapace di risolvere l’infezione e oggi si sa che  la risposta immune oltre che utile al controllo seppur parziale  dell’infezione è causa del danno polmonare provocato dall’infiammazione cronica.
Esiste un preciso pattern batterico età-specifico responsabile della malattia polmonare in FC.

I pazienti FC vanno incontro ad infezioni respiratorie fin dai primi mesi di vita; nei bambini i batteri più frequentemente isolati sono Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae, ma possono essere presenti anche Streptococcus pneumoniae ed Enterobacteriaceae. Successivamente, in età adolescenziale, subentra l’infezione da Pseudomonas aeruginosa e poi, con il progredire dell’età, subentrano altre co-infezioni sostenute specialmente da batteri opportunisti gram-negativi non fermentanti quali Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans e batteri appartenenti al gruppo Burkholderia cepacia complex.
È stato osservato che i primi batteri che colonizzano i polmoni FC sono S. aureus e H. influenzae, seguiti da P. aeruginosa ed è stato ipotizzato che i primi possano esacerbare l’infiammazione, così da facilitare la seguente colonizzazione delle vie aeree da parte di P. aeruginosa. 

Un problema sempre più frequente e preoccupante è lo sviluppo di microrganismi resistenti alla maggior parte di antibiotici comunemente usati al trattamento delle infezioni polmonari, da qui la necessità di ricerca e testare nuovi antibiotici. 

Materiali e metodi

 Lo scopo di questa tesi è stato quello di: 

  • raccogliere tutti i dati riguardanti l’epidemiologia dei pazienti FC afferenti al “Centro Trentino di supporto Fibrosi Cistica”, isolando ed identificando i vari microrganismi patogeni riscontrati nei materiali respiratori (espettorato, tampone faringeo profondo, aspirato ipofaringeo);

    fare una revisione critica del processo preanalitico;

    valutare la nostra casistica in rapporto ai dati della letteratura in particolare rispetto alle fasce d’età: pediatrica, adolescenziale e adulta.

    • È stata effettuata una sorveglianza microbiologica su 34 pazienti (13 maschi e 21 femmine) affetti da FC ed afferenti al “Servizio di supporto provinciale di Trento per la cura della fibrosi cistica” nel periodo fra luglio 2005 e agosto 2008.  

    • Il Laboratorio di Rovereto per l’esame dei materiali provenienti dalle basse vie respiratorie di pazienti affetti da FC (espettorato, tampone faringeo profondo, aspirato ipofaringeo) utilizza il seguente protocollo:

    •  Esame microscopico: viene eseguito su tutti i campioni di materiale respiratorio dei pazienti FC. Questo esame è fondamentale per valutare sia l’idoneità del materiale, attraverso il criterio di Bartlett, sia per definire in via presuntiva i probabili patogeni presenti nel materiale. 

    • Preparazione del campione: l’espettorato, prima di essere processato, deve essere fluidificato mediante l’aggiunta di un mucolitico, ditiotreitolo, in quantità uguale a quella del campione, vortexato per circa 10-15 secondi e incubato in termostato a 37°C per 30 minuti. 

    • Esame batteriologico colturale: consente di isolare i microrganismi, determinandone la loro carica microbica utile per discriminare un agente patogeno (presente in alte concentrazioni > 10 UFC/mL), responsabile di infezione, da un microrganismo contaminante (presente in basse concentrazioni < 10 UFC/mL)  . L’indicazione quantitativa della carica batterica è ritenuta indispensabile in quanto risulta utile per il monitoraggio della terapia antibiotica. Tale esame viene eseguito seminando il materiale respiratorio, opportunamente trattato, in diversi terreni di coltura (sia terreni ricchi che terreni selettivi e differenziali) permettendo così l’isolamento dei vari microrganismi eventualmente presenti.

    • La semina deve essere effettuata depositando su ogni terreno di coltura una quantità nota di materiale trattato (20 µL), strisciandolo poi su tutta la piastra con la tecnica dei “quattro quadranti”; in questo modo i batteri vengono dispersi sul terreno così da avere delle colonie isolate utili per effettuare prove di identificazione o per eseguire l’antibiogramma.
      Inoltre tale tecnica permette di stimare la carica batterica valutando il numero di colonie cresciute sul terreno. 

    • Identificazione dei microrganismi isolati: i microrganismi cresciuti sui vari terreni devono essere identificati sia per genere che per specie. Per fare ciò il Laboratorio di microbiologia di Rovereto si avvale di varie tecniche quali: 

    • Gallerie identificative: utilizzano una serie di test di assimilazione miniaturizzati. Ogni galleria è composta da diverse “cupole” (contenenti diversi substrati disidratati) che vengono riempite con una sospensione del batterio da identificare; il tutto viene poi  incubato a temperature e tempi prestabiliti. La lettura e l’interpretazione delle gallerie viene eseguita automaticamente con uno specifico strumento: mini-API® che utilizza due sistemi di lettura: turbinefelometrica e colorimetrica . 

  • Card identificative: ogni card possiede 30 pozzetti contenenti dei substrati chimici in forma disidratata. La card e la relativa sospensione del batterio da identificare vengono posizionati in uno specifico strumento (Vitek®2) il quale provvederà a inoculare la card ed a identificare il microrganismo in base all’assimilazione dei vari substrati chimici attraverso due sistemi di lettura: sistema ottico a fluorescenza e sistema ottico a trasmittanza.

Antibiogramma: o test di sensibilità è un’indagine di Laboratorio indispensabile per saggiare la sensibilità di un microrganismo a determinati antibatterici. Il Laboratorio di microbiologia di Rovereto si avvale di diverse metodiche quali: 

  • Disco diffusione – metodo Kirby-Bauer: il batterio da saggiare (stemperato in soluzione fisiologica ad un’opportuna concentrazione) viene seminato su appositi terreni dedicati a questo tipo di test, sui quali poi si posizionano dei dischetti imbevuti di antibiotici. Dopo opportuna incubazione si misura l’alone di inibizione di crescita attorno ad ogni dischetto; in base al valore di diametro misurato e confrontato con i valori forniti dal CLSI (Clinical Laboratory Standards Intitute) si determina se quel batterio è sensibile, intermedio o resistente all’antibiotico testato.

  • Metodi di diluizioni – MIC: questo metodo utilizza la stessa metodica descritta per l’identificazione con Card. L’unica differenza è che le Card per antibiogramma utilizzano substrati di antibiotici (e non biochimici). La lettura di queste Card avviene sempre con lo strumento Vitek®2 che provvederà a determinare se il microrganismo è sensibile, intermedio o resistente ai vari antibiotici testati. 

  • Metodi con breakpoints: consiste in gallerie contenenti, nelle varie cupole, solamente due diverse concentrazioni per ogni antibiotico da testare. Il metodo è uguale a quello descritto per le gallerie identificative. Anche le gallerie per antibiogramma vengono lette e interpretata dallo strumento mini-API® che provvederà a determinare se il microrganismo è sensibile, intermedio o resistente ai vari antibiotici testati. 

  • E-test®: o epsilon test è un metodo quantitativo in quanto fornisce il valore della concentrazione dell’antibiotico testato in cui avviene l’inibizione del microrganismo. Tale valore deve essere poi confrontato con i dati forniti dal CLSI per determinare la sua suscettibilità (sensibile o intermedio o resistente). Questo sistema consiste in una striscia di plastica dove su una faccia è riportata la scala di concentrazione dell’antibiotico mentre sull’altra faccia è immobilizzato l’antibiotico. La striscia viene posizionata su un particolare terreno di coltura sul quale è stato seminato il batterio da esaminare (opportunamente stemperato in soluzione fisiologica). Dopo opportuna incubazione si legge il valore in cui l’alone di inibizione interseca la striscia.

 Risultati: 

La sorveglianza microbiologica è stata studiata su 34 pazienti (13 maschi e 21 femmine) affetti da FC ed afferenti al “Centro di supporto Fibrosi Cistica” del Trentino con sede presso l’U.O. di Pediatria dell’Ospedale S. Maria del Carmine di Rovereto, nel periodo fra luglio 2005 e agosto 2008.
Per ogni paziente FC afferente al Centro è stata stilata una tabella contenente:

-          data della richiesta
-          tipo di materiale
-          esame microscopico del materiale
-          idoneità del materiale
-          carica batterica di ogni microrganismo isolato dal materiale
-          microrganismi isolati.

 Grafico I : Frequenza dei microrganismi isolati  

 



È stato eseguito uno studio generale sulla frequenza di ogni singolo microrganismo isolato fra tutti quelli riscontrati nei pazienti FC per un totale di 693 ceppi comprendenti sia batteri che funghi (Grafico II). Sono stati riscontrati 180 ceppi di batteri Gram-positivi (Grafico III), 278 ceppi di batteri Gram-negativi (Grafico IV) e 253 ceppi di miceti (Grafico V). 

Da questo studio è emerso che: 

  • S. aureus è il microrganismo più volte isolato in pazienti FC con una frequenza del 23% pari a 156 ceppi isolati
  •  P.aeruginosa è stato riscontrato nel 19% di tutti i microrganismi isolati pari a 131 ceppi
  • C. albicans è il lievito più volte isolato con una frequenza del 22% pari a 149 ceppi isolatiA. fumigatus è stato isolato 54 volte pari ad una frequenza dell’8%.

I restanti microrganismi isolati hanno una frequenza relativamente bassa, alcuni sono stati riscontrati solo una volta mentre altri hanno percentuali che variano dall’1% al 5%. 
B. cepacia complex, uno dei patogeni opportunisti più temuti nei pazienti FC, è stato riscontrato per 25 volte e tutti questi ceppi sono stati isolati dallo stesso paziente. 

Dalla nostra casistica si evince che S.aureus rappresenta il batterio gram-positivo più volte isolato; nella categoria dei batteri gram-negativi invece i più isolati risultano essere P. aeruginosa; H. influenzae; A. xylosoxidans; S. maltophila e Burkholderia cepacia complex.
Per quanto riguarda la categoria dei miceti si sono isolati varie specie del genere Candida e del genere Aspergillus. Tra i lieviti il più isolato risulta essere Candida albicans mentre fra i funghi filamentosi è sicuramente Aspergillus fumigatus.

Grafico II : Totale microrganismi isolati (totale 693 ceppi)

 

Grafico III : Batteri Gram-positivi (totale 180 ceppi)

 

Grafico IV : Batteri Gram-negativi (totale 278 ceppi)

 

Grafico V :  Miceti (totale 235 ceppi)

                          

È stato condotto anche uno studio sui microrganismi maggiormente riscontrati a seconda dell’età del paziente.
I pazienti sono stati così suddivisi in tre fasce di età:

 -         età pediatrica: 0 – 14 anni (Tabella II) 
-          età adolescenziale: 15 – 20 anni (Tabella III) 
-          età adulta: dai 21 anni in poi (Tabella IV).

Per ogni fascia di età è stata stilata una tabella che riporta il numero di microrganismi isolati per ogni paziente; si è scelto di osservare solo determinati microrganismi cioè quelli di maggiore interesse clinico per la patologia polmonare in pazienti FC quali: S. aureus; H influenzae; P. aeruginosa; S. maltophilia; A. xylosoxidans; Burkholderia cepacia complex; Aspergillus spp. e Candida spp.
È stato deciso di raggruppare tutte le specie di Candida sotto il nome di Candida spp. e tutte le specie di Aspergillus sotto Aspergillus spp.

La Tabella V e relativo Grafico VI riportano invece il totale degli isolati per ogni singolo microrganismo suddivisi per fascia d’età.

Tabella II : Fascia età pediatrica 0 – 14 anni (tot. 17 pazienti)

Tabella III : Fascia età adolescenziale 15 – 20 anni (tot. 5 pazienti)

Tabella IV : Fascia età adulta > 20 anni (tot. 12 pazienti) 

Tabella V : n° di microrganismi isolati per fascia d’età

 

Grafico VI : n° di microrganismi isolati per fascia d’età

 

Dallo studio delle Tabelle e Grafici sopra riportati, si può dedurre inoltre che:

  • S. aureus è presente in tutte le fasce di età con una maggiore incidenza nella fascia di età pediatrica e adolescenziale (in età pediatrica presente in 11 su 17 pazienti mentre in età adolescenziale in 4 su 5 pazienti) causando infezione e colonizzazione delle basse vie aeree;-

  • H. influenzae è un microrganismo che compre in FC in maniera marginale (solo il 5% sul totale degli isolati), è stato per lo più isolato in pazienti di età pediatrica ed adolescenziale dove si è riscontrato che l’infezione da H. influenzae spesso accompagna l’infezione da S. aureus;

  • P. aeruginosa: è il patogeno opportunista più rappresentativo in FC nell’età adulta, 8 pazienti su 12. Anche in età pediatrica, in 9 pazienti su 17, è stato isolato questo microrganismo, ma a differenza della fascia adulta, sono isolamenti sporadici e non continuativi.

  • S. maltophilia è un batterio gram-negativo non fermentante in crescente aumento negli isolati di pazienti FC. Tale microrganismo è stato identificato in 8 pazienti sul totale dei pazienti esaminati e ben 5 risultano appartenere all’età pediatrica in concordanza con i dati della letteratura.

  • A. xylosoxidans è un microrganismo opportunista che è stato isolato solo in 5 pazienti su 34 di cui 3 appartenenti alla fascia dell’età adulta;

  • i membri del Burkholderia capacia complex (BCC) rappresentano i patogeni opportunisti più temuti a causa dell’elevato numero di antibiotici a cui sono resistenti e dalla loro capacità di aggravare il quadro clinico del paziente. Questo microrganismo è stato isolato solamente in un paziente (25 isolati), rientrante nella fascia dell’età adulta, che risulta avere un’infezione cronica da BCC;

  • Aspergillus spp. comprende le due specie isolate in questi pazienti Aspergillus flavus e Aspergillus fumigatus; quest’ultimo è la specie più  frequentemente isolata (54 volte). Analizzando le tre fasce d’età si evince che in 9 pazienti sul totale di 34 è stato isolato il genere Aspergillus, 4 di questi in età pediatrica, uno in età adolescenziale e altri 4 in età adulta;

  • del genere Candida, C. albicans rappresenta il lievito maggiormente isolato  in pazienti FC. Analizzando le tre fasce d’età si può notare che il genere Candida spp. è presente in età pediatrica in 11 pazienti su 17; in fascia adolescenziale in tutti e 5 i pazienti e infine nell’età adulta in 10 pazienti su 12.

  In conclusione

  •  L’epidemiologia locale dei pazienti FC rispecchia quanto riportato nella letteratura scientifica nazionale e internazionale consultata, sia come tipologia di microrganismi che di frequenza di isolamenti rispetto alle fasce d’età considerate.


  • Considerando lo score di Bartlett come discriminante di idoneità del materiale respiratorio, si è potuto osservare che solo 32 campioni sui 327 totali (10%) sarebbero materiali poco significativi. Si evince quindi che il momento della raccolta del campione, seguita da personale specializzato (fisioterapista dedicata a pazienti FC), rappresenta un passaggio cruciale a garanzia della qualità della fase preanalitica.